光緒三十四年（1908年），慈禧太后先病倒了。而之後不久，光緒帝也神祕地得病，臥牀不起。這年十月十八日，一位叫屈桂庭的醫生進宮爲光緒帝治病，發現光緒帝本已逐漸好轉的病情卻突然惡化，還在牀上亂滾，大叫肚子痛。3天之後，光緒帝就駕崩了。
相比之下慈禧太后臨死前不久，神志仍然十分清醒。軍機大臣張之洞此時還建議慈禧發佈上諭。其中包括：立醇親王載灃之子溥儀入承大統爲嗣皇帝，封醇親王載灃爲攝政王。而在知道光緒皇帝駕崩之後，慈禧太后便又下諭讓溥儀繼承皇位。由於“嗣皇帝尚在沖齡，正宜專心典學，著攝政王載灃爲監國，所有軍國政事悉秉予之訓示，裁度施行”。就在諭旨發出去後不久，也就是光緒皇帝駕崩後一天的下午，這個掌控光緒一生一世的慈禧太后也隨之去世了。
光緒和慈禧兩位冤家似的人物，在如此相近的時間內紛紛去世，再加上兩人生前不共戴天，光緒之死隨之引起了許多學者的關注。光緒到底是自然死亡還是死於謀殺？
有人認爲，年事已高的慈禧太后怕自己一死，光緒皇帝會重新掌權來報復自己，於是便想辦法害死了他。據著名文獻學家、書畫家啓功所說，啓功的曾祖父曾親眼看到太監給光緒送慈禧太后賞賜的塌喇（即酸奶）。而在這之後不久，光緒皇帝就駕崩了。從醫生屈桂庭的看病結果來看，也說明光緒皇帝的病情本已好轉，只是不明原因的突然惡化。因此，啓功懷疑是慈禧用下了毒的酸奶毒死了光緒皇帝。
也有人說毒死光緒的是李蓮英，而不是慈禧。根據《清室外記》記載，李蓮英平日裏經常中傷和作弄光緒帝，由於怕慈禧死後，光緒重新掌權對自己不利，所以先下手爲強，用陰謀害死了光緒皇帝。英國人普蘭德所著的《慈禧外傳》和德齡所寫的《瀛臺泣血記》等書也認同此說法。
20世紀30年代，軍閥混戰，光緒皇帝的陵墓曾一度被軍閥炸開。對光緒的遺體進行研究，同時通過分析檔案館所藏的清官脈案中光緒皇帝的病案，得出結論，證明光緒皇帝就是病死的。而他和慈禧太后先後而死，只不過是歷史的巧合而已，並沒有是什麼內幕消息。
但是，這一結論後來被推翻了。2008年11月，國家清史工程編纂委員會主持的“清光緒皇帝死因報告會”在北京舉行。這次報告會，公佈了一份採用現代刑偵和高科技手段檢測的1萬字報告，證實光緒確死於砒霜中毒。至此，光緒的死因百年謎案終於獲解。
不過，到底是誰下毒殺死了光緒卻還需要進一步的調查才能揭開謎底。
