吳祿貞生於一個知識分子家庭，家有薄田10畝，父親爲私塾老師。少年時，吳祿貞就讀於父親在武昌的夢澤書屋，他擅長詩文，對西學充滿興趣，性格豪爽，少有大志，8歲時，曾寫下對聯：“一拳打倒亞細亞，兩腳踢翻歐羅巴”。
1895年父吳利彬去世，其被迫到湖北織布局當童工。後因爲女工抱不平，痛打工頭而離開。1896年懷着爲國雪恥的志願，入湖北新軍工程營當兵，後又考入湖北武備學堂。與孫武、傅慈祥等志同道合的愛國青年成爲摯友。他的《投筆從戎爭先赴》令張之洞十分讚賞有加，被大量油印，在新軍軍營和武備學堂內廣爲散發。
1898年，被張之洞推薦入日本士官學校學習陸軍騎兵科深造，成爲我國留日第一期士官生。在校結識了張紹曾、藍天蔚，三人學習成績突出，志趣不凡，後來被人們稱爲“士官三傑”。他看到明治維新後的日本在戰敗中國之後飛速發展，大爲震驚，痛感非改革政治、傾覆清室，不能轉弱爲強。決心以革命排滿爲己任，走上革命道路。留日期間，吳祿貞除了刻苦學習軍事知識，對於西方民主思想也多有參研，併發起組織了留日學生的第一個愛國團體“勵志會”。後吳祿貞在橫濱拜訪了孫中山，被孫中山的革命思想所吸引，加入興中會。
1900年，義和團運動爆發。孫中山決定在珠江、長江流域乘勢起義，派吳祿貞、傅慈祥祕密回國，與唐才常共同謀劃。吳祿貞和秦力山指揮的自立軍前軍爲庚子年長江流域大舉中唯一發難者。自立軍起義失敗後，吳祿貞重返日本。
1901年冬，吳祿貞從士官學校畢業，回到武昌後，被張之洞扣押。在審訊時，張之洞反被吳祿貞說服，委他以重任，任武昌武普通學堂教習、會辦，一時轟動武漢。吳祿貞利用職務之便並繼續從事革命活動，廣泛撒播革命火種，祕密翻印陳天華的《警世鐘》、《猛回頭》等革命書刊，散發到學堂、軍隊。創建了國內第一個祕密組織“花園山聚會”，倡導“秀才當兵”，使得一批具有新思想的知識分子從軍，大大加強了軍隊本身的文化程度。
1903年，吳祿貞應黃興邀請，同李書城、耿覲光等人前往長沙與黃興、宋教仁、陳天華等在湖南發起組織華興會，積極協助黃興制訂在長沙起義的計劃，籌劃湖南獨立。恰逢此時，清廷在北京設立練兵處編練新軍，急需用人，吳祿貞被在日本士官學校的好友良弼舉薦獲准。黃興勸他“投身中央，伺隙而動”，吳遂北上就職。1904年5月奉調入京，任練兵處軍學司訓練科馬隊監督。在京期間，仍與湖北志士暗中聯繫。劉靜庵被捕後，他曾竭力援救。
1906年赴新疆伊犁考察新軍。因忤陝甘總督升允，被撤去監督差使，被扣留於蘭州。
1907年7月，徐世昌任東三省總督，吳祿貞隨行任軍事參議。此時，日本製造輿論，妄圖以吞併中國“間島”地區。吳祿貞提出“籌邊之道，貴在知邊”，爲徐世昌所接納，被派往延吉調查邊務，任延吉邊務幫辦。8月，吳祿貞得到日人已在間島附近集結的消息，立即召開會議，與當地民團首領韓登舉取得聯繫。經過妥善佈置，吳祿貞向日人頭目齋藤季治致信，要求交涉。交涉當日，韓登舉率隊伍遠遠佈陣，齋藤以爲中方早有準備，心中忐忑，不得不引手下撤出中國邊境，嘆曰：“中國尚有人在，如吳祿貞者，不可欺也。”之後，吳祿貞在徐世昌支持下主持編寫了《延吉邊務報告書》，並繪有《延吉邊務圖》。後來中方以此爲談判的重要依據，終於讓日軍徹底退出了間島地區。
1908年11月，吳祿貞回京不久，日人又開始製造糾紛，清廷再次調吳祿貞前往延吉。1909年5月升延吉邊務督辦，並任陸軍協都統。1909年9月4日，《圖們江中韓界務條款》在京簽訂，堅持了中韓以圖們江爲界河的歷史事實，吳祿貞因間島功績，被譽爲“間島英雄”!
光緒、慈禧相繼亡故後，攝政王載灃企圖削弱袁世凱軍權，故於1910年調吳祿貞入京，孫中山、黃興對此相當重視，李書城也建議吳祿貞爭取外放，以便更好進行革命工作。吳祿貞用同盟會提供的鉅款活動奕劻成功，謀得駐紮保定的新軍第六鎮統制之職。新軍第六鎮是袁世凱的嫡系部隊，原統制爲段祺瑞，軍中大小官員皆是袁世凱親信，對於吳祿貞的上任充滿了敵視。
1911年，武昌起義爆發，陸軍大臣蔭昌調第六鎮李純所部南下，吳祿貞請求隨軍南下卻被清廷拒絕。這時，屯兵灤州的張紹曾舉行兵諫，要求雙方停戰、清政府實行立憲。清政府派吳祿貞前往平息，吳祿貞到了灤州後卻鼓動張紹曾起義，策應武昌起義，顛覆清王朝，張紹曾猶豫不決。
武昌起義後，赴灤州約張紹曾等舉兵反清，又赴石家莊與山西革命黨聯繫，擬聯合北方新軍直搗北京。後由奸細告密未成。他斷然截留北洋軍運往湖北的軍火，並電奏清廷，要求停止進攻漢口。清廷懷疑其爲革命黨，但又不敢貿然將其撤換，特授予署理山西巡撫以籠絡。
隨即山西也爆發了革命，閻錫山被推爲山西革命軍都督，清廷調吳祿貞率第六鎮前往鎮壓。吳祿貞卻在娘子關與閻錫山會談，組建“燕晉聯軍”，商定於11月7日共討北京。11月2日，吳祿貞向清廷謊稱山西民軍已接受招安，並以“消弭戰爭”爲由在石家莊扣留了北洋軍運往湖北的軍火，吳祿貞的舉動令清廷產生了懷疑。袁世凱指使其死黨周符麟用二萬元收買了吳部下馬步周和其他幾個軍官。11月7日凌晨，馬步周率幾名打手闖進吳的住所將其槍殺，然後又割下吳祿貞的首級，以便向主子請功。吳祿貞就這樣被袁世凱祕密買兇殺死，年僅31歲。
民國成立後，孫中山特頒第一號撫卹令，諡吳祿貞爲大將軍，於1912年3月14日在上海張園召開吳祿貞追悼會，親筆寫下悼詞“蓋世之傑”以緬懷這位壯志未酬的青年才俊。孫中山在祭文中寫道：“代有偉人，振我漢聲。觥觥吳公，蓋世之傑，雄圖不展，捐軀殉國……”，
