第16師團是舊日本帝國陸軍的一個甲種師團，代號“恆”。在日俄戰爭中於1905年7月18日以後備役部隊在京都編成，其司令部設於京都，官兵主要來自京都、三重縣和奈良縣，故又稱爲“京都師團”。在編成的當年即派往滿洲參加了日俄戰爭。直到9月5日朴茨茅斯和約簽訂。戰後變成了日本的17個常備師團之一，1919年和1929-1934年兩次在滿洲駐紮。1935年日本京都暴雨時曾參加了搶險活動。
在進軍南京途中，製造了無數暴行，開展“百人斬”殺人比賽即爲其一。第十六師團在上海附近登陸時，日軍已佔領了上海，於是，時任日軍華中方面軍司令官的鬆井石根即命令該師團向南京追擊從上海撤退的中國軍隊。第十六師團在中島今朝吾的率領下，先後攻佔了常熟、蘇州、無錫、常州、丹陽、句容、湯水鎮、麒麟門，進抵南京東郊的紫金山一線。該師團沿途燒殺淫掠，其暴行不勝枚舉。在向南京進軍的途中，該師團由於進軍速度太快，補給跟不上，便下令就地“徵收”糧秣，所謂“徵收”，實際上就是掠奪。 當時被日本《東京日日新聞》等報紙大肆宣揚的所謂“百人斬”就發生在該師團。第十六師團在從無錫向常州追擊過程中，該師團第十九旅團步兵第九聯隊第三大隊副官野田毅少尉和大隊炮小隊長向井敏明少尉，相約在到達南京時，看誰先用日本刀斬殺滿100人。此後，兩軍官開始大肆斬殺，在到達南京城外的紫金山時，野田毅斬殺了105人，而向井敏明斬殺了106人。
1937年12月10日，日軍向南京城發起總攻擊，第十六師團的主攻方向爲中山門。要佔領中山門，必須先佔領中山門外的制高點紫金山。12日，第十六師團步兵第三十三聯隊在重炮的掩護下，向紫金山頂峯發起攻擊，戰鬥異常激烈，紫金山上一片火海。經過激烈的戰鬥，日軍在付出沉重代價後佔領了紫金山主峯。
1937年12月13日凌晨，第十六師團步兵第二十聯隊佔領了中山門。當天，該師團第三十三聯隊和第三十八聯隊在輕型裝甲車的配合下，從太平門外沿玄武湖急進至南京城北的下關江邊，以截斷中國軍隊的退路。下午，當第三十三、第三十八聯隊進至下關時，長江邊有大批准備渡江的中國軍人，江面上也有許多正在渡江的中國軍人。日軍立即用機槍進行猛烈掃射，一時間江水被染得殷紅。在長江邊等待渡江的中國軍人有些返回南京城內，避入安全區，有些被日軍射殺或俘獲。接着，日軍在長江邊將俘獲的中國軍人加以集體屠殺。
南京淪陷後，第十六師團根據事先制定好的計劃，對南京城內及城外東郊地區進行“掃蕩”。在“掃蕩”過程中，第十六師團俘獲了許多放下武器的中國軍人。對於俘虜，中島今朝吾在其日記中記述說：“敗逃之敵大部進入第十六師團作戰地區的林中或村莊內，另一方面，還有從鎮江要塞逃來的，到處都是俘虜，數量之大難以處理。”“基本上不實行俘虜政策，決定採取全部徹底消滅的方針。”“僅佐佐木部隊就處理掉約15000人，守備太平門的一名中隊長處理了約1300人。在仙鶴門附近集結的約有七八千人。此外，還有人不斷地前來投降……處理上述七八千人，需要有一個大壕，但很難找到。預定將其分成一兩百人的小隊，領到適當的地方加以處理。”“這些敗兵的處理，大多由第十六師團負責，因此師團無暇顧及入城或宿營等，只是一味地東奔西走。”第十六師團步兵第三十旅團長佐佐木到一也在日記中記述說：“接連不斷地有俘虜前來投降，其數量高達數千人。情緒亢奮的士兵絲毫不理睬上級軍官的勸阻，將俘虜一個個地殺死。回想到許多戰友流的血和十天來的艱難困苦，別說士兵了，我自己也想說‘全都幹掉吧’。
”
日軍佔領南京後，以第十六師團步兵第三十旅團爲南京警備部隊，佐佐木到一擔任警備司令。所謂“警備”，實際上就是搜捕放下武器，在國際安全區避難的中國士兵。第十六師團在“掃蕩”殘敵過程中，在國際安全區進行所謂的甄別搜捕，將頭上有帽痕，手上有老繭的青壯年男子從難民中強行拉走，予以集體屠殺，其中許多人是普通的平民。在搜捕中國士兵的過程中，一些毫無軍紀可言的日軍官兵還大肆強姦婦女、搶劫財物。在戰後對日本戰犯的審判中，許多南京市民指證日軍“中島部隊”的暴行。所謂“中島部隊”，就是以中島今朝吾爲首的第十六師團。
南京淪陷後，第十六師團在南京駐紮到1938年1月22日，此後，日軍第十一師團步兵第十旅團(天谷支隊)接替第十六師團步兵第三十旅團，擔任南京的警備任務。第十六師團由海路開往大連，重新編入日軍華北方面軍第二軍戰鬥序列，後又被編入華中派遣軍戰鬥序列。1938年7月，中島今朝吾升任駐紮在滿洲的日軍第四軍司令官，由藤江惠輔(中將)繼任第十六師團長。
太平洋戰爭爆發後，第16師團被編入本間雅晴中將的第14軍，進攻菲律賓，參加了第一、第二次巴丹半島攻堅戰和鎮壓菲律賓各島抗日活動的討伐戰，之後駐屯在菲律賓。
1944年夏秋，爲加速太平洋戰爭的進程，麥克阿瑟決定率部奪取菲律賓，而日軍準備在菲律賓與美軍決一死戰。作爲第十四軍主力的第十六師團駐守在萊特島。 10月12日，美軍4個師登陸萊特島，第16師團集中兵力死守塔克羅班機場，殊死決戰。月底，日軍第一、第二十六師團和第六十八旅團等部先後增援萊特島，並使用“神風”自殺飛機攻擊美軍艦船，戰局一度呈膠着狀態。
最終覆滅
麥克阿瑟提出以兩面夾擊的方式佔領奧莫克港，從背後分割日軍。這一方案成功實施，日軍第十六師團大部分被圍殲，殘部退到坎基伯特山進行遊擊戰。日軍士兵以同伴屍體爲食的情形就是發生於此。萊特島的攻防戰持續到了1944年12月，日軍損失慘重。12月15日，美軍在呂宋島附近的明德羅島登陸。日軍所規劃的萊特島決戰喪失戰略意義，日軍大本營命令在萊特島守軍“自給自足，永久抗戰”，第十六師團殘部在熱帶雨林中飽受飢餓、瘧疾、脫水的折磨，大部在恐懼與無助中死亡，少數人組成自殺隊逃進深山，直到日本投降才放下武器。戰後統計，第16師團有13778名官兵參加了萊特島戰役，戰死13158名，倖存僅620名，師團長牧野四郎中將在1945年8月10日被擊斃。
