試衛館時期
嘉永元年11月11日(1848年12月6日)，勝五郎入門江戶試衛館修習劍術天然理心流。曾擊退盜賊的勝五郎實力得到近藤周助認可，嘉永2年10月19日(1849年12月8日)被周助的宗家島崎家收養爲養子，改名島崎勝太。後正式成爲近藤家養子，改名島崎 勇。安政五年(1858年)-文久元年(1861年)期間再改名爲近藤 勇。萬延元年(1860年)與清水家家臣，鬆井八十五郎的女兒鬆井つね結婚。隔年8月於府中六所宮(今東京賽馬場附近)，爲繼承天然理心流第四代掌門人一事進行比試，最後通過比試成爲天然理心流宗師。文久二年(1862年)，近藤勇長女?たま(瓊子)誕生。
文久三年(1863年)、清河八郎向江戶幕府第14代將軍德川家茂提議組織守護京都治安的浪人組織“浪士組”，並開始募集。包括土方歲三、沖田總司等試衛館道場的8名成員和沖田林太郎等人決定一同加入浪士組上京。2月8日，浪士組開始出發前往京都。行經中山道，並於2月23日抵達京都，並在當地壬生郷士八木源之丞之宅第休息定居。
然而浪士組的招集人清河八郎事實上是個勤王論者，佐幕上京維持治安只是一個藉口罷了。在清河八郎向朝廷提交的建白書內容，以及隨後在壬生村新德寺向浪士們宣稱成立“浪士組”的真正目的並非保衛京都安全，而是勤王的先鋒，再再說明了浪士組只不過是他用來增大自己勢力的棋子。
看透清河立場的近藤與水戶鄉士芹澤鴨等人強力反對清河，最後共24人留駐京都。京都守護職會津藩主鬆平容保向幕府遞交嘆願書說明狀況後，將剩餘浪士納入京都守護名下。改名爲“壬生浪士組”，開始了守護京都治安，防止勤王派浪人肆意破壞、暗殺(天誅)、縱火之活動。此時近藤勇29歲。
然而壬生浪士組成立之初波折不斷，組內暗殺致死事件多傳。文久三年(1863年)3月25日，爲壬生浪士組成員之一殿內義雄客死他鄉(另說爲暗殺)。根岸友山一派成員粕谷新五郎脫離浪士組，阿比留榮三郎病死(一說爲暗殺)，家裏次郎切腹。最後壬生浪士組大致上以近藤勇的試衛館派(試衛館成員)與芹澤鴨的水戶天狗派(水戶天狗黨等人)的3局長模式共同管理壬生浪士組事務。
文久三年8月18日(1863年9月29日)，薩摩藩與會津藩的公武合併派朝臣密謀把長州藩公卿中川宮朝彥親王(尹宮)趕出京都政治圈，對此感到憤慨的長州藩激進派浪人與防守堺町門的薩摩藩與前來支援的會津藩衛士發生武裝衝突，史稱八月十八日政變。在政變中，壬生浪士組守護御花園門有功，由朝廷下賜“新撰組”一名。文久三年(1863年)9月16日(一說18日)，芹澤一派被試衛館派暗殺成功，新撰組因而再度改變成爲近藤勇主導的中央集權體制。
元治元年(1864年)6月，熊本藩宮部鼎藏同志之一古高俊太郎遭新撰組捕獲，受不了土方歲三嚴刑的古高俊太郎透露了長州藩企圖火燒中川宮邸，以及綁架天皇至長州藩之計劃。擔心宮部鼎藏得知後會提早行動的新撰組分頭搜索京都，並於旅館池田屋找到正在商議行動的宮部一派，近藤勇、沖田總司、永倉新八、藤堂平助首先衝進去廝殺，以十人殲滅池田屋裏面尊王攘夷派人士約三十人，後世稱爲池田屋事件。得知消息後的幕府公開致贈感謝狀與賞金表揚新撰組功勞。禁門之變後，近藤勇爲了募集團員歸鄉。隨後接納伊東甲子太郎入隊。慶應元年(1865年)，侍奉永井尚志前往廣島。接着慶應三年，近藤勇正式成爲幕臣，並得到御目見得(可與將軍面見議事)的身分，近藤勇可以幕府代表的身分與各要人談判交涉。
慶應三年(1867年)3月20日，伊東甲子太郎以監視薩摩藩名義組織御陵衛士，與新撰組分離。藤堂平助、齋藤一(近藤的臥底)也加入其中。11月18日，在近藤勇的策劃下，伊東甲子太郎在回家途中於油小路遭到大石鍬次郎等人暗殺。之後更誘出剩下御陵衛士圍剿之。御陵衛士派的報復行動則是在同年12月18日，於伏見街道遭到御陵衛士殘黨槍擊負傷，因故無法指揮新撰組參加鳥羽伏見之戰而在大阪城療傷。
戊辰戰爭
鳥羽伏見之戰戰敗後的新撰組搭乘幕府軍艦回到江戶。慶應四年(1868年)，受幕府之命，改名爲大久保 剛的近藤擔任甲陽鎮撫隊巡撫，向甲州出陣。但在甲州勝沼之戰敗給新政府軍。此時，因爲意見紛歧的原因永倉新八、原田左之助離隊。之後再度改名爲大久保 大和的近藤在五兵衛新田(今東京都足立區)招募舊政府(幕府)士兵繼續反抗。然4月卻在下總國流山地區(今千葉縣流山市)休息時，遭新政府包圍。近藤等人被帶往越谷(今埼玉縣越谷市)的政府軍總部。
以大久保大和之名投降的近藤勇，被帶往板橋總督府(今東京都板橋區)。然而其化名卻被原本御陵衛士之一的加納鷲雄識破。
1868年4月25日，在平尾一里冢(今東京都北區瀧野川)斬首。享年35。次日送往京都，首級放於三條河原示衆。
