和同治帝一樣，光緒帝正當盛年時卻突然死去，成爲慈禧垂簾聽政之下的第二個犧牲品，而且他的死與慈禧的死僅相差一天。因而，關於他的死因也就引起了世人的種種猜測。
第一種觀點認爲光緒是患重病而死。在廢立風波中，光緒依舊做他的皇帝，但他的實權卻丟了，精神也備受打擊。光緒帝重重的顧慮極大地影響了他的健康。另外光緒帝自幼孱弱，脾胃素來虛弱。光緒雖貴爲天子，卻連一個孤兒也不如。據宮中太監寇連材日記說，當時宮中人受各種限制，不能親近光緒。惟有西太后可以親近他，而她當時驕奢淫逸，對光緒的生活根本不管。小皇帝每天有數十種菜，但菜皆不能入口。光緒要加菜，御膳房必先告知太后，慈禧必然責備他鋪張浪費，不懂節儉，光緒只好從小捱餓。
光緒在這種情況下，很容易患上重病。《清德宗實錄》、《清史稿》、《光緒朝樂華錄》等都說光緒久病體虛，至光緒三十四年病入膏肓，最後駕崩，但這些均爲官方文件，可信度不一定高。
第二種說法最爲流行，說是慈禧謀害了光緒帝。持這種觀點者認爲光緒雖然長期被囚，保皇黨卻極依靠他。慈禧自己身體健康，能執政時，百般折磨光緒。晚年，她力不從心了，便想害死他。當時因擔任起居注官而能接近光緒的惲毓鼎，寫了一部《崇陵存信錄》(又名《光緒外傳》)，記錄了光緒臨死前的狀況：光緒三十四年(公元1908年)秋忽然傳出病重消息，召京外名醫入宮診視。診脈時，光緒靜靜地把雙手置案上，自己寫出病情。入診者都說光緒身體尚健。
十月初十，逢慈禧萬壽節(生日)，光緒出瀛臺，替太后祝壽，有人看見他爲準備跪拜而活動筋骨。十九日，宮廷大亂，增加侍衛，稽查出入，傳言光緒駕崩。次日，宮中恢復了寧靜，午後，傳載灃監國、溥儀入宮教養之命。二十一日，皇后入瀛臺探視，光緒早已氣絕身亡。太后聞此，僅嘆息幾聲。
在這則記錄裏，惲毓鼎實際上暗示慈禧害死了光緒。而且，慈禧宣佈光緒病重，和百日維新後廢立風波之做法一樣。惲氏長期任起居注官，他的話具有一定的可信度。
而曾在宮中擔任女官的德齡女士，則在《清宮二年記》等書中，明確地指明正是李蓮英下毒害死了光緒。
