亞歷山大率領馬其頓大軍繼續穩步前進，不時停頓以保持陣線的完整緊湊。馬其頓右翼的近衛騎兵率先進入波斯人的弓箭射程，正停下來等待左側的近衛步兵方陣跟上來，河對岸的波斯弓箭手立刻萬箭齊發。古典史料記載，波斯人發射的羽箭如此密集，以至於在空中相互碰撞，據此我們可以推測，這應該是來自波斯步兵陣營後面的弓箭手以45度高射角的齊射。雖然波斯箭雨未能對近衛騎兵造成足夠威脅，但有數十匹戰馬受驚狂跳，亞歷山大見此情況，不等步兵跟上來，率先衝向敵陣，他的近衛騎兵各個連隊以楔形隊形緊跟其後。馬其頓騎兵衝進皮納羅河時，又遭遇波斯馬迪亞部隊迎面而來密如飛蝗的弓箭直射。大概在波斯人三次齊射的功夫，亞歷山大就率領近衛騎兵衝到近前。馬迪亞弓箭手魂飛魄散，紛紛轉身逃命，慌不擇路，衝亂了後面的卡爾達克密集陣。接踵而至的馬其頓重騎兵如摧枯拉朽一般突入波斯步兵陣線，而近衛步兵各個方陣也陸續過河接敵，將波斯防線的缺口越撕越大。由於波斯步兵方陣異常厚實，馬其頓重騎兵突進敵陣以後很快就陷入人海寸步難行。近衛騎兵習慣於高速衝擊，並不擅長在狹小空間裏同步兵肉搏，這時馬其頓軍隊的步騎協同發揮了威力。跟進的近衛步兵投出手中的長矛以後，紛紛拔出短劍衝入敵陣格鬥。羅馬史學家科丘斯寫道：“雙方陣線犬牙交錯，士兵揮舞着刀劍格擋劈砍，向對手暴露的面部猛刺。現在即使膽怯懦弱的人也無法逃避戰鬥，雙方步兵逼近肉搏，只有對手倒下才能前進一步。雖然(馬其頓步兵)廝殺得筋疲力盡，他們的對手依然前仆後繼衝到面前，而傷者根本無法撤下戰場，因爲敵人不斷涌來，而自己的戰友拼命在身後向前推擠。” 在馬其頓軍隊步騎協同的凌厲攻勢之下，波斯左翼陣線不久便土崩瓦解。
幾乎在亞歷山大率領近衛騎兵發動進攻的同時，波斯右翼的鐵甲騎兵也向馬其頓左翼遠端發起衝鋒。由於這裏的戰場寬度不足500米，波斯騎兵不得不採取添油戰術，逐次投入兵力。第一攻擊波的數千鐵甲騎兵組成密集隊形衝過皮納羅河，朝600希臘聯盟騎兵猛撲過來，很快將他們擊潰，然後整體左轉，向馬其頓左翼陣線的側後迂迴包抄，從兩面攻擊步兵密集陣左側的2千弓箭手和標槍手。馬其頓左翼陣線岌岌可危。在這關鍵時刻，亞歷山大部署在密集陣後面的1,800特薩利重騎兵發動反擊，猛攻波斯騎兵的右側，一舉衝散了敵軍的隊形，逼迫波斯騎兵後退重新集結。特薩利騎兵以連爲單位組成菱形戰術隊形，可以輕易調整進攻方向，他們向忙於集結的波斯騎兵連續發動短促突擊，最後將波斯人驅逐到河對岸。特薩利騎兵乘勝渡河追擊，同波斯騎兵的主力部隊發生激戰，由於兵力懸殊，戰況膠着起來。
帕馬尼奧率領馬其頓密集陣冒着箭雨渡河，艱難爬上陡峭的河岸，越過波斯人設置的鹿砦，向波斯陣線的希臘僱傭軍發起進攻。過河以後，許多馬其頓士兵受地形阻礙沒能跟上，這樣密集陣前沿就出現了許多缺口，而右側同亞歷山大的近衛步騎兵已經脫節，希臘僱傭軍所期待的戰機終於出現。大批手持圓盾和短劍的僱傭軍士兵立刻衝進馬其頓陣線的缺口和右翼側面，猛攻密集陣暴露的部位，馬其頓步兵不得不扔掉長矛，拔出短劍格鬥。伊蘇斯戰役最血腥殘酷的戰鬥發生在這裏，雙方士兵風格相似，實力相當，彼此以死相拼殺紅了眼，彷彿希臘和馬其頓兩個民族之間的新仇舊恨要在此一併清算。馬其頓密集陣傷亡慘重，包括團級指揮官托勒密(Ptolemy of Seleucus)在內的馬其頓軍官120人在此陣亡，士兵傷亡數千人。由於希臘僱傭軍加上右側的卡爾達克步兵有3萬人，兵力佔有3比1的絕對優勢，逐漸將馬其頓密集陣逼退。這樣除了亞歷山大在右側進展順利以外，中路和左翼的形勢都不容樂觀。
其實戰局正朝着亞歷山大預想的方向發展。馬其頓密集陣將波斯步兵主力緊緊吸引住，正好起到一塊砧板的作用，而亞歷山大此時就要高舉近衛騎兵這把利刃，對大流士痛下殺手。波斯左翼潰散以後，馬其頓的右翼在亞歷山大的率領下向左旋轉，近衛步兵開始攻擊希臘僱傭軍的左翼，而亞歷山大率領近衛騎兵從側後方直撲大流士。波斯希臘僱傭軍抵擋不住來自兩面的攻擊，不久陣形就瓦解，但是頑強的僱傭軍士兵們依然三五成羣，和步步逼近的馬其頓密集陣殊死搏鬥，因爲他們都知道格拉尼克斯戰役希臘僱傭軍的下場，於是人人抱定必死的決心。亞歷山大挺矛衝在最前面，完全不顧自己的安危，近衛騎兵在主帥身先士卒的感召之下奮勇向前，很快馬其頓騎兵就衝到了大流士的兩千禁衛騎兵陣前。
以大流士的兄弟奧薩特雷親王(Oxyathres)爲首的一批波斯貴族和他們的衛隊拱衛於大流士的周圍，外圍是波斯王的禁衛軍。波斯貴族一如既往地以身作則鼓舞士氣，奧薩特雷是享譽波斯的勇士，他率部擊潰了突破波斯禁衛軍防線的一股馬其頓騎兵，親手將數人砍落馬下。在這場混戰中，波斯人的單打獨鬥和馬其頓人的組織紀律性形成鮮明對比，後者始終保持嚴整的隊形互相照應。大流士的戰車周圍，雙方陣亡將士的屍體堆積如山，在此喪命的波斯貴族包括埃及總督薩巴西(Sabaces)和格拉尼克斯戰役倖存的騎兵將領里奧米特雷(Rheomithres)等人。
就在這關鍵時刻，波斯王大流士逃離戰場。希臘史學家迪奧多羅記載，大流士座車的役馬受驚，拖着他向敵陣衝去，車伕根本駕馭不住。大流士不得不放下波斯王的架子親自拉住繮繩，戰車才停下來。這時戰車距離敵陣近在咫尺，大流士看到有被馬其頓人活捉的危險，頓時驚惶失措。他跳上戰車後面備用的一匹馬，脫掉身上的王袍，在奧薩特雷的保護下逃之夭夭，殘餘的一千禁衛軍緊緊跟隨。大流士的逃遁一舉摧毀了整個波斯陣營的戰鬥意志，本來秩序井然的波斯大軍剎那間土崩瓦解。騎兵統帥納巴扎尼發現波斯王已經逃跑，立刻下令撤退。波斯騎兵擁擠在狹窄的海岸邊上奪路而逃，肆意踐踏擋道的步兵，此役波斯軍隊傷亡的大部分發生在逃亡途中。唯一在退卻中能夠保持隊形完整的是殘餘的8千希臘僱傭軍，他們井然有序且戰且退，越過阿曼山脈南行，撤到敘利亞北部的特里波利港(Tripoli)，登上波斯海軍前來接應的運輸船逃生。這8千希臘僱傭軍後來投奔斯巴達國王阿吉斯，兩年後跟隨他起兵進攻馬其頓，在美加羅波利戰役中全軍覆沒。亞歷山大率騎兵追出四十公里，卻不見波斯王的蹤跡。大流士早已取道阿曼山口，一路不斷換馬，晝夜兼程逃回巴比倫。
